多数氨基酸都有一个以上的密码子，通过E.coli密码子应用情况的分析表明一些密码子很少被使用，尤其是Arg，IIE，Leu，Gly，Pro等氨基酸的部分密码子。一个或多个tRNA的稀有或者缺少可能导致翻译的终止， 尽管含有少量稀有密码子不会给目的蛋白表达造成太大的影响，但是如果一个蛋白基因中含有多个或者成串稀有密码子的时候，目的蛋白的表达将会非常低。如果是基因是野生型的，我们最好先对其做个稀有密码子分析，如果密码子稀有的程度不高，可以使用Rosetta菌株用于表达这些含稀有密码子基因的目的蛋白。如果密码子稀有程度过高，最佳的处理方式是经过密码子优化后直接进行基因合成。